Western blot成像方法取決于二抗的標(biāo)記物，常用的方法有基于酶促反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法，基于熒光染料的可見(jiàn)熒光方法和紅外熒光方法，那么我們應(yīng)該如何選擇呢？
*合適的Western blot實(shí)驗(yàn)方法取決于您期望獲得哪些信息，也就是取決于您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，小編比較了現(xiàn)有方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并分享了自己的心得，希望能夠幫助您選擇到*佳的實(shí)驗(yàn)方法。
化學(xué)發(fā)光方法
化學(xué)發(fā)光western blot是相對(duì)容易且靈敏度*的檢測(cè)方法，靈敏度可以達(dá)到fg級(jí)。
適用于研究：通過(guò)電泳可輕松分離的分子量差異顯著的蛋白。
> 檢測(cè)單一蛋白
> 確定蛋白有無(wú)
> 檢測(cè)抗體反應(yīng)
> 蛋白純度分析
> 檢測(cè)低豐度蛋白
| 優(yōu)勢(shì) | 劣勢(shì) |
| 靈敏度高 | 半定量 |
| 實(shí)驗(yàn)流程熟悉 | 酶促反應(yīng) |
| 兼容膠片和數(shù)字成像系統(tǒng) | 一次只能檢測(cè)單一信號(hào) |
| 需要玻璃和重孵育 | |
| 膠片沒(méi)有過(guò)飽和提醒 |
熒光檢測(cè)方法
熒光染料分為可見(jiàn)熒光染料和紅外熒光染料，從而將熒光western blot檢測(cè)分為可見(jiàn)熒光檢測(cè)和紅外熒光檢測(cè)。目前可見(jiàn)熒光檢測(cè)*多三個(gè)通道，可以同時(shí)檢測(cè)三種不同的蛋白，近紅外檢測(cè)*多為兩個(gè)通道，一定選擇激光光源激發(fā)的哦，更接近近紅外染料的*大發(fā)射波長(zhǎng)680nm和800nm，增強(qiáng)二抗信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。
熒光Western blot使用熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，膜上的靶標(biāo)蛋白濃度與可見(jiàn)熒光信號(hào)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)真實(shí)可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。在無(wú)需剝離和重孵育條件下，進(jìn)行上樣量質(zhì)控，可以分析翻譯后修飾蛋白。
因此當(dāng)您進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)室，選擇熒光檢測(cè)方法，妥妥的：
> 同時(shí)檢測(cè)多種蛋白
> 研究翻譯后修飾蛋白
> 同一印跡膜的上樣質(zhì)控
> **定量western blot實(shí)驗(yàn)
| 優(yōu)勢(shì) | 劣勢(shì) |
| 可進(jìn)行多重檢測(cè) | 膜會(huì)有自發(fā)熒光 |
| 定量 | |
| 信號(hào)持久穩(wěn)定 | |
| 實(shí)驗(yàn)方法不需改變太多 |
期刊雜志要求：
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓勵(lì)在一張印跡膜上進(jìn)行內(nèi)參和目的蛋白的的檢測(cè)，同時(shí)使用合理的標(biāo)準(zhǔn)化方法：例如：全蛋白歸一化。
化學(xué)發(fā)光屬于酶促反應(yīng)，動(dòng)態(tài)范圍窄，只能實(shí)現(xiàn)定性分析，一次只能檢測(cè)一個(gè)信號(hào)，如要檢測(cè)多個(gè)信號(hào)，需要?jiǎng)冸x和重孵育，如使用膠片成像，還需要反復(fù)摸索曝光時(shí)間，顯影定影設(shè)備和設(shè)備的維護(hù)，熒光檢測(cè)可同時(shí)滿足期刊雜志發(fā)表要求、一次可進(jìn)行多個(gè)信號(hào)檢測(cè)，反應(yīng)條件一致，jingzhun定量，特別近紅外熒光檢測(cè)方法，具有低背景，高信噪比，是現(xiàn)在western blot熒光定量的金標(biāo)準(zhǔn)。
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